附件6：
體外診斷試劑生產及質量控制技術指導原則
——生物芯片類試劑生產及質量控制技術指導原則
（征求意見稿）
前 言
本指導原則所定義的生物芯片診斷試劑是指將多個生物探針（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗體，組織，細胞等）按預先設計的排列方式固定在特制的基質（包括玻璃片，尼龍膜，硝酸纖維素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并進行標記，然后與固定在基質上的生物探針特異性的結合，再用相應的檢測設備（如激光掃描儀、CCD檢測儀等）和分析方法（包括軟件）進行檢測、記錄、分析，實現對生物靶分子的定性或定量檢測的試劑。
根據芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分為核酸芯片、蛋白芯片、細胞芯片、組織芯片、芯片實驗室等。本指導原則是針對核酸和蛋白為檢測靶分子生物芯片的生產及質量控制技術指導原則，其它類型靶分子檢測的芯片診斷試劑可參考本指導原則。
由于生物芯片技術還在不斷發展，國家食品藥品監督管理部門可依據科學技術發展的需要，適時組織對本指導原則進行修訂。
一、基本原則
（一）生物芯片診斷試劑生產用的物料包括：原料，輔料和包裝材料。各種物料應當制定相應的質量指標，并應符合有關法規的要求。
（二）生物芯片診斷試劑的生產企業應具備相應的專業技術人員，相適應的儀器設備和生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》；應當按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；應當通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。
（三）生物芯片診斷試劑的研制應當按照科學、規范的原則組織研發，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。
（四）生物芯片診斷試劑生產過程中所用的物料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。
二、物料質量控制
（一）核酸檢測芯片
核酸芯片檢測時，從生物樣本中提取的核酸可用熒光標記、金標記和酶標記。檢測方法包括光譜學方法和化學顯色。下面為熒光標記芯片技術指導原則，采用金標記和酶聯顯色等的生物芯片診斷試劑可參照核酸芯片和蛋白芯片相關部分。
1、主要生物原料
核酸檢測芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探針、標記物等。應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料的供應商要求相對固定，不得隨意變更供應商。
（1）模板DNA
重組DNA：經測序驗證，關鍵位置沒有錯誤。1×TE溶解，濃度為1μg/μl以上，-20℃保存。
（2）dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP）
HPLC純，PCR級，無DNase、RNase污染。-20℃以下保存。外購者，由生產廠家提供質量保證證明，達到生產要求。
（3）引物
序列確證；進行PCR擴增后，克隆測序鑒定驗證，建立引物標準品。生產中的引物原材料為凍干粉，PAGE純或HPLC純，外購者，供應商應提供該產品的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜；自己合成的引物，需有PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。用標準DNA模板擴增，電泳檢測，譜帶單一，大小正確，與對照引物比較，產物量一致。符合視為合格引物。-20℃以下保存。
（4）探針（用于陣列制備）
重組DNA, 凍干粉（或1×TE溶解液）：每種90μg以上，酶切鑒定分析圖譜。
PCR產物，凍干粉（或1×TE溶解液）：每種90μg以上，PCR電泳鑒定圖譜。
合成寡核苷酸：PAGE純或HPLC純，每種90μg以上，提供該產品的PAGE電泳分析圖譜或HPLC分析圖譜。外購者，供應商應提供質量保證證明，達到生產要求。
探針序列的正確性：應用克隆鑒定的標準DNA雜交鑒定或進行測序鑒定。外購者，供應商應提供質量保證證明，達到生產要求。
純度和濃度檢測：用電泳方法，電泳圖譜沒有雜帶，目標條帶的強度與已知濃度的標準DNA條帶進行參比計算其強度。純度較高的DNA，可用紫外分光光度計進行定量。檢定合格后入庫。避光、-20℃以下保存。
（5）標記物
含有激發光波長和發射光波長介于280~680nm的所有熒光分子，HPLC純，供應商應提供質量保證證明。
（6）Taq DNA聚合酶
SDS-PAGE 檢測，純度＞95%，具DNA聚合酶活性，無核酸外切酶活性及核酸內切酶活性，具熱穩定性，94℃1小時后仍保持50％活性，由供應商提供質量保證。-20℃保存。
（7）UNG（尿嘧啶糖基化酶）
具尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。1U UNG 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板被降解后，不能產生擴增產物，供應商提供質量保證。-20℃保存。
（8）RT 酶
具有逆轉錄活性，供應商提供質量保證。-20℃保存。
（9）RT-PCR酶
具逆轉錄酶活性和DNA聚合酶活性，無核酸外切酶活性及核酸內切酶活性，具熱穩定性，94℃1小時后仍保持50％活性。-20℃保存。
（10）緩沖液
各類酶制品需要的的反應緩沖液由廠家隨酶制品提供，供應商提供質量保證。-20℃保存。
2、主要生物輔料
（1）雜交液
購買成品者，供應商提供質量標準，并按要求保存。自制雜交液，按半成品檢定標準要求進行檢定。
（2）酶類
蛋白酶、核酸酶等，供應商提供質量標準，并按要求保存。
（3）核酸提取試劑
供應商提供質量保證，并按要求保存。如果是自制提取液，按半成品檢定要求。
（4）魚精DNA
供應商提供質量保證，并按要求保存。
（5）封閉用蛋白
包括牛血清白蛋白，奶粉等，提供質量標準，并按要求保存。
3、主要化學原輔料
參照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別進行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值檢測、溶解情況檢測、干燥失重的檢測、熾灼殘渣等。
主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量質量保證材料和質量檢驗報告，其質量標準應達到生產所需的質量標準。
（1）無機類
主要包括氯化鈉、氫氧化鈉、純化水等。
（2）有機類
主要包括有丙酮、乙醇、枸櫞酸、吐溫20、乙二胺四乙酸二鈉、氨基吡啉等。
（3）特殊化學原料
聚乙二醇，多聚賴氨酸，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）、溴化乙錠（EB）、染色劑等。
4、其他物料
（1）載玻片
外觀：明亮處用肉眼觀察無缺刻，無劃傷等。規格按設計要求。
激光掃描儀掃描（波長為芯片檢測波長）：包被層基本均勻。
（2）試管、吸頭、試劑瓶等
一次性使用，由生產廠家提供質量保證，達到設計要求。
（3）其他：說明書、包裝外盒等
參照國家食品藥品監督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》執行。
（二）蛋白檢測芯片
1、主要生物原料
與生產的產品質量最密切相關的生物原料包括各種活性抗原、重組抗原、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類生物原科。這類原料可用于點膜、標記相關酶、納米金、光學基團及中和反應用抗原或抗體等。使用前應按工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量要求。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，必須進行原料驗證，并進行補充申報。
主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：
（1）外觀
肉眼觀察，大部分生物原料為澄清透明的液體，不含異物，渾濁或搖不散的沉淀；或者為白色粉末，不含有其他顏色的雜質；特殊生物原料應具備相應外觀標準。
（2）純度和分子量
主要通過SDS-PAGE電泳和電泳結果掃描儀進行檢測，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。作為免疫診斷試劑用生物原材料，用銀染法染色后，純度一般都要大于90％；用考瑪氏亮藍染色后；純度一般都要大于95％。SDS凝膠電泳法測定分子量。
（3）蛋白濃度
蛋白濃度可通過Lowry法、280nm光吸收法、雙縮脲方法等進行檢測；
（4）效價
效價的測定一般根據蛋白含量測定結果通過倍比稀釋法進行。效價應達到設計規定的要求。
（5）功能性實驗
功能性實驗是指生物原料用于試劑盒試劑實際生產中的情況，一般考查該原料使用后的試劑靈敏度、特異性和穩定性。
2、主要生物輔料
生物輔料指的是在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料均應按照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》所規定的質量標準要求進行檢驗，達到相應的質量標準后方應用于生產。
生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。
對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制10％濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯免疫測定，均不得出現非特異性反應。
對于標記用酶，應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢定方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應大于3.0。
3、化學原輔料
參照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別進行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值檢測、溶解情況檢測、干燥失重的檢測、熾灼殘渣等。
主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量質量保證材料和質量檢驗報告，其質量標準應達到生產所需的質量標準。
（1）無機類
主要包括氯化鈉、氫氧化鈉、純化水等。
（2）有機類
主要包括有丙酮、乙醇、枸櫞酸、吐溫20、乙二胺四乙酸二鈉、氨基吡啉等。
（3）特殊化學原料
DAB（聯苯二胺），染色劑等。
4、其他物料
（1）基質
以硝酸纖維素膜為例：孔徑符合設計要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛細遷移速度±20％）、尺寸（與標識吻合）
（2）瓶子和干燥劑
由生產廠家提供質量保證，達到規定要求。
（3）其他：說明書、包裝外盒等
應參照國家食品藥品監督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》執行。
三、試劑盒各組分的生產
生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、組織芯片、細胞芯片以及芯片實驗室等。生物芯片診斷試劑產品基本可分成二個部分，一部分是芯片，另一部分檢測用工作液。如果有配套的檢測儀器，還需對儀器及處理軟件的應用加以說明。
（一）芯片的生產
芯片生產的基本過程包括探針的獲取方法，純化，點樣，固定。
1、探針獲取
不同的芯片，主要是探針不同，生物芯片的探針主要包括以下幾類，其它探針可參考制定相應的技術及質量標準。
（1）DNA探針的獲取
探針的形式有PCR產物、克隆DNA、人工合成DNA片段等；要求有生產程序和質量指標及檢測方法，要進行純化，有固定的純化程序。
（2）抗原的生產
抗原的獲得方法包括細胞培養、從生物材料中分離提取、基因工程表達以及合成肽等。基因工程表達產物又分為純抗原蛋白、融合蛋白等。
（3）抗體
抗體分單克隆抗體和多克隆抗體。抗體制備包括細胞培養，動物腹水，基因工程表達等方式。
（4）細胞和組織
包括細胞或組織類型，固定方法。組織材料還包括固定，包埋，切片等。
（5）芯片實驗室，包括各種管道泵的制作等。
2、陣列的排列設計
陣列的排列包括依次排列、隨機排列、對角線排列等，設計時需考慮重復次數等。
3、點陣的制作
使用儀器的要確定型號，程序；手工制作的也要有標準操作程序。
4、固定：包括固定方式，固定的條件等。
應對芯片生產的過程進行相應的質量控制，如點樣和固定過程的監控、點樣均一性檢驗等。
（二）工作液配制
1、芯片生產所需試劑，包括細胞培養基，探針制備試劑，陣列制作和固定試劑等。
2、樣品處理試劑，芯片檢測靶分子分為核酸和蛋白質。檢測核酸的樣品處理試劑包括臨床取樣，DNA提取或RNA提取試劑，逆轉錄試劑，PCR擴增試劑，核酸標記試劑等；檢測蛋白的處理試劑包括取樣試劑，蛋白稀釋液以及特殊試劑等。
3、反應液：檢測核酸時的反應液包括預雜交液，雜交液，洗脫液等；檢測蛋白時，包括封閉液，抗原/抗體反應液，洗脫液，顯色液，顯色終止液等。
（三）數據判讀
1、判斷標準及依據，包括Cut off值的確定依據。
2、數據判讀方式：人工還是軟件判讀。
3、如果是軟件判讀，應提供軟件判斷的科學依據（包括生物學原理、數據獲取原理和判斷實驗是否成立的依據）以及實驗測試的原始報告（或數據），并需要說明：
（1）軟件的來源：購買或自己編制，是否獲得注冊等。
（2）軟件的用途：包括對數據的分析、存儲、解讀、含義等。
（3）軟件的使用：基本的使用程序。
四、半成品質量控制
（一）抽樣
檢驗人員按批號抽取檢定需要數量的半成品，作好標記，待檢。
（二）質控品
可用克隆并測序鑒定的DNA或經特異性鑒定的抗原（或抗體）。質控品的基質應盡可能與被測物基質相一致。
（三）檢定要求
1、芯片檢定
（1）靈敏度：最低檢測限達到規定要求。
（2）特異性：應達到規定要求。若進行全陰、全陽和交叉反應檢測，全陰性檢測應在沒有靶分子存在時，所有檢測位點沒有檢測信號；全陽性檢測應在加入足夠量的靶分子，所有檢測位點均有檢測信號；交叉反應檢測時，用某一位點的靶分子檢測，應只有該位點有檢測信號，其它位點不能有檢測信號。
（3）精密性（均一性）：用比最低檢測限高一個數量級的質控品，重復檢測10次，判定結果一致。
考慮到芯片的多位點檢測，因此要進行全位點和單個位點進行檢測。半成品檢定可以用克隆DNA和鑒定的抗原和抗體作質控品。
2、工作液的檢定
（1）物理檢測：外觀顏色正常，沒有雜質。
（2）質量檢定：用被檢定的工作液檢測標準樣，檢測結果達到預定要求。
五、成品質量控制
（一）生產批量
申報生產的批量每批原則上不低于1000人份。
（二）抽樣
檢驗人員按批號抽取檢定需要數量的半成品，做好標記，待檢。
（三）標準品（參考品）
應用國家標準品或參考品進行檢定，若無國家標準品（參考品），可以使用企業參考品，但其標準不得低于第一家已經獲得批準的該類試劑。
（四）檢定要求
1、靈敏度：應達到規定要求。
2、特異性：應達到規定要求。
3、精密性（均一性）：對某一樣本，重復10次，對病種的定性檢測結果一致。
4、穩定性（僅對蛋白芯片）
37℃放置至少3天，靈敏度、特異性和精密度仍達到規定要求。熱加速破壞試驗的時間長短，可由生產單位根據不同產品在37℃貯存與常溫貯存（2℃~8℃）中質量變化的相關性來決定。
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