指導原則編號

弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒2型抗體及IgG抗體親合力檢測試劑

注冊申報資料技術指導原則

（征求意見稿1）

注冊申報資料技術指導原則

一、前言

本指導原則旨在指導注冊申請人對弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒2型抗體及IgG抗體親合力檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒2型抗體及IgG抗體親合力檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

二、范圍

人類感染弓形蟲( Toxoplasma, TOXO ) 、風疹病毒( Rubella virus , RV) 、巨細胞病毒(Cytomegalovirus , CMV) 及單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus type 2, HSV-2) 四種病原體時通常無癥狀或癥狀輕微，但可能給孕婦、新生兒和免疫力低下人群帶來極高的醫療風險。

上述四種病原體具有以下幾個共同點：1. 可以通過胎盤垂直傳播，引起胎兒宮內感染。2. 宮內感染后可能導致流產、早產、死胎和畸形。3. 病原體感染對胎兒造成的危害，與孕婦感染的孕齡相關。為引起圍產醫學家和優生優育學家的關注，將四種病原體組合在一起，以縮寫形式ToRCH命名。

依免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)重鏈抗原特異性不同，Ig可分為IgG、lgM、IgA、IgE和IgD五種類型。ToRCH抗體檢測試劑，主要檢測的Ig為病原體特異性IgG和IgM。在病原體感染的初次體液免疫應答中(原發性感染)，特異性IgM抗體首先出現，但其普遍反應短暫，一般幾周后即不易再測到。病原體特異性IgM抗體陽性常提示早期感染，可用于感染急性期的輔助判斷。特異性IgG抗體，在免疫接種后、原發性感染及再次感染時都可檢出，且長時間存在。

在感染過程中特異性抗體對抗原親合力隨感染時間而不斷升高，檢測抗體IgG的親合力，能夠更準確地判斷感染時間，可作為ToRCH抗體檢測的一種補充，輔助排除近3至4個月以內的近期原發性感染。

 不同類型的ToRCH特異性抗體檢測結果，在育齡婦女的預防接種、孕婦的監測方式及治療處置方式的選擇中，起著重要的指導作用，因此ToRCH特異性抗體檢測的準確性至關重要。相關的生產企業必須充分意識到該類產品的潛在風險，根據本指導原則的要求對該類試劑的安全性和有效性進行科學合理的驗證。

ToRCH抗體檢測試劑是指一類利用免疫學方法，如酶免疫技術、化學發光免疫分析技術等，對育齡婦女、孕婦血清或血漿樣本中，ToRCH特異性抗體進行體外定性和/或半定量和/或定量檢測的試劑。結合臨床表現和其他實驗室指標，可作為ToRCH感染輔助診斷的指標之一，用于治療方案的制定及免疫狀態的評估。IgG抗體親合力檢測試劑是指一類對ToRCH特異性IgG抗體陽性的孕早期婦女血清和/或血漿樣本中ToRCH特異性IgG親合力進行體外定性檢測的試劑。用于輔助判斷感染時間，排除近3至4個月以內的近期原發性感染。本類試劑尚不用作產前篩查。本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

三、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品臨床適用癥背景情況、預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學及臨床適用范圍等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料注冊申報資料的重要組分之一，其內容應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監械[2007]609號）的相關要求，另外，建議申請人對以下幾方面內容進行著重介紹：

1．特定病原體的生物學特性，包括形態與結構、抵抗力、感染過程等。

2．特定病原體感染的傳播途徑、潛伏期、不同人群感染的臨床癥狀、流行病學以及易感人群的說明。

3. ToRCH特異性抗體及特異性IgG抗體親合力動力學。

4．對申報試劑檢測結果可能帶來的風險進行合理評估，即由申報試劑的假陽性/假陰性結果導致的對孕婦的不恰當處理等方面的負面影響。

（二）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、標本采集及處理、實驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨注明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對ToRCH抗體和IgG抗體親合力檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】  應至少包括以下幾部分內容：

（1）① 試劑盒用于育齡婦女和/或孕婦體外定性和/或半定量和/或定量，檢測人血清和/或血漿樣本中xx的特異性IgG或IgM抗體。用于ToRCH病原體感染的輔助診斷、免疫狀態的評估及醫療措施的制定。

     ② 試劑盒用于體外定性檢測孕早期婦女血清和/或血漿樣本中xx的特異性IgG親合力。作為ToRCH抗體檢測的一種補充，用于輔助判斷感染時間，排除近3至4個月以內的近期原發性感染。

（2）簡單介紹病原體的特征，如特定病原體的生物學特征、流行病學、潛伏期、易感人群、不同人群感染后的臨床表現、不同孕齡感染后引起胎兒宮內感染的風險及可能對胎兒產生的危害等臨床背景相關的信息介紹；適用人群的介紹，如具有何種癥狀/體征的患者、相關的密切接觸者、相關疾病流行情況、地域要求等。

（3）人群中ToRCH特異性抗體的陽性率、ToRCH特異性抗體的產生、持續時間、臨床提示作用、與ToRCH核酸和抗體親合力等其他檢測指標的關聯。

（4）ToRCH感染的臨床或實驗室診斷方法介紹。

（5）明確說明ToRCH特異性IgM抗體檢測不得用于無癥狀人群的產前篩查；不得將本試劑的檢測結果單獨作為終止妊娠的依據。

（6）特異性IgG抗體的親合力檢測試劑還應介紹親合力動力學，親合力高低與感染時間的關系。并明確不得將本試劑IgG抗體的低親合力結果單獨作為近期急性感染判斷的依據。

關于預期用途的幾點考慮：（1）ToRCH抗體檢測試劑作為病原體抗體檢測試劑，目前臨床意義僅限于抗體陰陽性及IgG抗體親合力高低的判斷和病原體特異性IgG抗體滴度變化趨勢的觀察。（2）定量檢測試劑可溯源至國家或國際標準品如WHO等標準品。鑒于現在國際標準品的情況和臨床需求，建議ToRCH IgM檢測試劑的預期用途定義為定性檢測。（3）如申報產品聲稱可用于疫苗免疫效果的評判，則必須以定量試劑盒的形式進行申報。（4）抗體親合力檢測項目的確定，應建立在明確的臨床意義和技術可行性基礎上。

2.【主要組成成份】 

（1）說明試劑盒包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息；質控品、校準品，應明確具體基質成份，由于可能含有人源組分，應提供滅活方法及無傳染性確認的方法等。另外，校準品應明確溯源性，質控品應提交靶值單。

（2）對檢測中使用的抗原及抗體的信息進行簡單介紹，包括抗原的性質（如重組抗原、純化的天然抗原、病毒感染細胞的裂解物等）、所用病毒株或重組抗原的表達載體、抗體的動物源性、抗體的性質（單克隆或多克隆）。

（3）試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組份，企業應列出相關試劑的名稱、貨號及其他相關信息。

3.【儲存條件及有效期】

對試劑盒的效期穩定性、開封穩定性、運輸穩定性等信息做詳細介紹。

4.【適用機型】

    對于采用酶聯免疫吸附法的檢測試劑應明確適用酶標儀的波長要求，其他方法學檢測試劑應明確具體的適用機型型號。

5.【樣本要求】  重點明確以下內容：

（1）樣本采集前的要求：如采集時間、采集順序等，是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

（2）樣本采集：說明采集方法及樣本類型，如有血漿樣本，應注明對抗凝劑的要求。

（3）干擾物的影響：明確脂血、溶血、常用治療藥物等常見干擾物對實驗結果是否產生影響，明確可接受的最大干擾物濃度。明確生物污染、纖維蛋白等是否影響檢測。

（4）樣本處理及保存：樣本處理方法、保存條件（如冷藏、冷凍等）及不同保存條件下的保存時限和運輸條件等。冷藏、冷凍樣本檢測前是否需要恢復室溫，冷凍樣本的凍融次數限制。經熱處理樣本是否可用、對儲存樣本的添加劑要求等。

（5）對于ToRCH病原體IgM抗體檢測試劑，如果檢測系統含有某種IgG抗體的去除技術（IgG吸附劑），如抗人IgG抗體等，則應包括IgG吸附劑使用相關的注意事項。例如：經IgG吸附劑處理的樣本不能用于IgG類抗體的檢測；在檢測IgM類抗體的同時，檢測處理過的混合物中的IgG類抗體，以證實對IgG和RF等去除的有效性。

（6）對于IgG抗體親合力檢測試劑應明確適用的特異性IgG抗體陽性樣本的濃度范圍。

6.【檢驗方法】  詳細說明試驗操作的各個步驟

（1）實驗環境：檢測試劑及樣本的復溫要求及相關注意事項。例如：凍存樣本在復融后應經過充分的混勻再行檢測。

（2）試劑配制方法、注意事項，試劑開封后使用方法及注意事項等。

（3）高濃度樣本稀釋的方法及注意事項。

（4）試驗條件：操作步驟、溫度、時間、儀器波長以及試驗過程中的注意事項等。

（5）定標（如適用）：標準曲線的制定，對需要進行重新定標情況的說明及對定標周期的建議。

（6）質量控制：操作步驟，質控結果的要求（試驗有效性的判斷），質控結果不符合要求的處理方式。如果質控品和病人樣本的使用方法不同，生產商應注明必要的指導和解釋。建議在質控品結果解釋環節注明以下字樣：“如果質控結果與預期不符，實驗室不應出具檢測報告。”

7.【檢驗結果的解釋】

詳細描述檢測結果的判定標準或計算方法。對陰陽性及血清轉換或親合力高低臨床意義的說明，對后續試驗的建議。例：對于巨細胞病毒IgG抗體檢測灰區樣本，建議另外進行巨細胞病毒IgM抗體檢測或于2周后進行重復檢測；對于IgG抗體親合力灰區樣本應于2周后進行重復檢測。對于半定量和定量的特異性IgG抗體檢測試劑，還應明確抗體滴度變化的意義。由于在對孕婦急性感染的輔助診斷中，ToRCH IgM假陽性結果可能造成嚴重的后果，建議提示用戶對所有ToRCH IgM陽性結果應結合臨床病史及其他的檢測結果綜合判斷，不得作為ToRCH急性感染診斷的唯一依據。

對于ToRCH IgG定量檢測試劑，由于抗體的檢測結果與檢測方法及量值的溯源性相關，不同檢測系統間的結果可能不一致。應注明：“不同檢測系統的結果不能交互使用”字樣。

對于IgG抗體親合力檢測試劑，還應明確指出應配合相應的ToRCH IgG和IgM抗體檢測試劑結果進行分析。其中TOXO IgG抗體親合力檢測試劑，應提示用戶檢測的低親合力結果不得作為近期急性感染判斷的依據。

8.【檢驗方法局限性】

綜合產品的預期用途、臨床背景、檢測方法及適用范圍等信息，對可能出現的局限性進行相關說明，主要包括以下描述，請申請人選擇適用的條款在產品說明書中予以闡述。

（1）本產品檢測結果僅供臨床參考，不應作為臨床診治的唯一依據，對患者的臨床管理應結合其癥狀/體征、病史、流行病學、其他實驗室檢查（如病原學檢測）等信息綜合考慮。

（2）感染初期，ToRCH特異性抗體未產生或滴度低于檢出限，會導致陰性結果，如懷疑有病原體感染，應提示患者在一段時間內復查，如2周以上，抽取第二份樣本，并和第一份樣本在同條件下同時檢測，以確定是否有初次感染的血清轉化或ToRCH特異性IgM或IgG抗體滴度明顯升高。（企業應注明第一份樣本的保存條件，并提交相應的支持資料。）

（3）ToRCH特異性IgG陰性，可能出現于疾病急性感染的早期，此時特異性IgM呈陽性。

（4）對于ToRCH IgM抗體檢測試劑，高滴度ToRCH特異性IgG抗體會與特異性IgM抗體競爭抗原結合部位，會使檢測的敏感性降低，特異性IgM抗體結果可能會出現假性低值或陰性結果。

（5）由于孕婦ToRCH IgM抗體的實驗室檢查存在較高的假陽性風險，不能可靠地鑒定胎兒患病的風險，故不建議對無癥狀孕婦的ToRCH IgM抗體進行篩查。不得將本試劑的檢測結果單獨作為終止妊娠的依據。

（6）免疫功能受損或接受免疫抑制治療的患者，如人類免疫缺陷病原體（HIV）感染患者或器官移植后接受免疫抑制治療的患者，其血清學抗體及抗體親合力檢測的參考價值有限，可能會導致錯誤的醫學解釋。

（7）在近幾個月內接受過輸血或其他血液制品治療的人群，對其陽性檢測結果的分析應慎重。

（8）部分ToRCH（如風疹病毒）特異性IgM抗體不僅出現于初次感染，當二次感染和復發感染時也可能出現。個別個體的ToRCH特異性IgM抗體,在初次感染較長時間后仍能檢出，因此對特異性IgM抗體陽性在判斷初次感染時間的解釋中應慎重。

（9）當處于低流行率地區的無癥狀人群或已接種過特定ToRCH疫苗的b個體檢出ToRCH IgM陽性結果時，應警惕可能出現的假陽性結果。同時建議用戶結合其癥狀/體征、病史、流行病學、其他實驗室檢查（如IgG親合力和病原學檢測）進行判斷。建議對申報試劑臨床研究中的病例人群特征進行說明，并對適用人群的性別、年齡、地域等特征進行明示。

（10）人血清中的異嗜性抗體可能與試劑中的Ig結合干擾試驗結果，對于經常接觸動物或動物血清制品的人群，應警惕可能出現的異常干擾結果。

（11）接受過小鼠單克隆抗體治療的患者樣本中，可能含有人抗小鼠抗體（human anti-mouse antibodies, HAMA）。對于試劑盒組成成份中含有小鼠源性抗體的檢測試劑，若待測樣本中含有HAMA，會影響檢測結果的準確性。

（12）體內存在的高濃度的鏈霉親合素（親合素）抗體和發光標志物抗體會影響檢測結果。

（13）采用間接法檢測ToRCH特異性IgM抗體的檢測試劑，由于方法學特點可能受到樣本中IgG類抗體的競爭結合，實驗在樣本處理過程中通過加入IgG吸附劑，可去除樣本中××mg/dL的IgG類抗體。如企業未對吸附劑的影響進行驗證，應注明“未對吸附劑可能對檢測結果產生的影響進行研究。”字樣。

（14）由于ToRCH IgG抗體親合力成熟過程存在個體差異，個別個體在初次感染較長時間后仍呈現ToRCH IgG抗體低親合力，因此不得將本試劑IgG抗體的低親合力結果單獨作為近期急性感染判斷的依據。

9.【產品性能指標】 詳述以下性能指標：

（1）對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。

（2）最低檢測限（分析靈敏度）：說明試劑的最低檢測濃度或滴度，簡單介紹最低檢測限的確定方法。

（3） 企業內部陽性和陰性參考品符合率，簡單介紹陽性參考品的來源、濃度梯度、陰性參考品的組成、來源以及濃度梯度設置等信息。

（4） 精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準。

（5） 分析特異性

①交叉反應：對易產生交叉反應的其他病原體的高水平抗體、高濃度ToRCH特異性IgG抗體等的驗證情況。

②干擾物質：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如溶血、高脂、黃疸等干擾因子研究（結果應量化表示，禁用輕度、嚴重等模糊表述），有關高濃度總IgM和總IgG抗體、抗核抗體、類風濕因子、系統性紅斑狼瘡患者血等的干擾驗證。

③藥物影響：常用處方及非處方藥物對檢測結果的影響。

（6）鉤狀（HOOK）效應：對高濃度ToRCH特異性抗體鉤狀效應的驗證情況。

（7）對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

（8）抗體滴度變化（適用于半定量和/或定量檢測試劑）和診斷靈敏度：介紹血清轉換盤的來源，將檢測結果以圖或表的形式列出。

（9）稀釋線性（適用于半定量和/或定量檢測試劑）：簡要介紹評價方法，將評價結果以表格的形式明示。

（10）檢測范圍（適用于半定量和/或定量檢測試劑）：簡要介紹檢測范圍確定的方法及超出檢測范圍樣本的處理方法。

10.【注意事項】應至少包括以下內容：

（1）有關試劑盒內人源組份（如有）生物安全性的警告。如：試劑盒內對照品（質控品）或其它可能含有人源物質的組份，雖已經通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組份作為潛在傳染源對待。

（2）有關實驗操作、樣本保存及處理等其他注意事項。

（三）擬定產品標準及編制說明

擬定產品標準應符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》的相關規定。另外，對于國產試劑，應參考《中國生物制品規程》（2000年版），將擬申報產品的主要原材料、生產工藝及半成品檢定等內容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產品分類”項中引出該附錄內容。

ToRCH抗體定性檢測試劑的注冊檢測應主要包括以下性能指標：物理性狀、陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析靈敏度）等。半定量和/或定量抗體檢測試劑除上述性能指標外，還應包含線性和準確性指標。陽性參考品主要考察對不同滴度情況下的檢測符合性。陰性參考品則是對分析特異性（交叉反應）的驗證，應主要包括易發生交叉反應的其他病原體特異性抗體和常見干擾物質的假陽性情況的考核。ToRCH IgG抗體親合力檢測試劑，應包含符合率及精密度等要求。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低于上述標準要求。

（四）注冊檢測

根據《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產品應該在國家食品藥品監督管理局認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢測機構進行連續三個生產批次樣品的注冊檢測。對于已經有國家參考品的項目，在注冊檢測時應采用相應的國家參考品進行,對于目前尚無國家參考品的項目，生產企業應自行建立穩定的質控體系并提供相應的內部參考品。

（五）主要原材料研究資料

1．試劑盒所用病原體抗原的制備、篩選、純化以及鑒定等詳細試驗資料，主要包括以下兩方面：

（1）企業自制抗原

如為天然抗原，則應對病原體毒株選擇、病原體培養、抗原提取及純化、鑒定等實驗過程予以詳述；如為重組抗原，則應提交有關特定基因選擇、基因序列、質粒轉化、抗原表達及抗原純化、鑒定等詳細內容。

（2）企業外購抗原，則應詳述抗原的名稱及生物學來源，外購方名稱，提交外購方出具的抗原性能指標及檢驗證書，詳述申請人對該抗原技術指標的要求以及申請人確定該抗原作為主要原材料的依據。供貨商應相對固定，不得隨意更換。

2．試劑盒所用抗體的制備、篩選、純化以及鑒定等詳細試驗資料，主要包括以下兩方面：

（1）企業自制抗體

如使用天然抗原作為免疫原則應明確該天然抗原的來源；如使用重組抗原或其他人工合成抗原作為免疫原，應提供相應的核酸組分及重組抗原的序列信息。申請人對所選抗體的技術指標要求（如外觀、純度、蛋白濃度、效價等），確定該抗體作為主要原材料的依據；

（2）企業外購抗體，應詳述抗體的名稱及生物學來源，外購方名稱，提交外購方出具的抗體性能指標及檢驗證書，詳述申請人對該抗體技術指標的要求以及申請人確定該抗體作為主要原材料的依據。供貨商應相對固定，不得隨意更換。

  3.其他主要原輔料的選擇及驗證資料，如固相載體、化學發光劑、反應緩沖液等，該類原輔料一般均為外購，應詳述每一原輔料的外購方名稱，提交外購方出具的每一原輔料性能指標及檢驗證書，詳述申請人對每一原輔料技術指標的要求以及申請人確定該原輔料作為主要原輔料的依據。

4.試劑盒內質控品和/或校準品的制備、定值和/或溯源及相關的實驗驗證資料。校準品應溯源至現行的國家或國際參考品，質控品應至少包含陰性和陽性兩個水平。校準品和質控品基質應與待測樣本相同或相似。

5.企業內部參考品的原料選擇、制備、定值、統計學分析及相關的實驗驗證資料。應提供對參考品性質確認的方法或試劑（建議采用國內已上市的、臨床上普遍認為質量較好的同類試劑）的相關信息。陰性參考品除正常血清樣本外，還應包含可能產生干擾的溶血、脂血、黃疸及自身免疫性疾病患者血和其它易混淆、交叉的感染性疾病患者血的特異性血清樣本。

（六）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.主要生產工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產工藝的確定依據。

2.產品基本反應原理介紹。

3.包被工藝研究，申請人應考慮如包被液量、濃度、時間等指標對產品性能的影響，通過試驗確定上述指標的最佳組合。

4.顯色（發光）系統、酶作用底物等的介紹。

5.實驗體系反應條件確定：申請人應考慮反應時間、反應溫度、洗滌次數等條件對產品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。

6.酶催化底物（發光或變色）的最適條件研究。

7.體系中樣品加樣方式及加樣量確定：申請人應考慮樣品加樣方式、加樣量對產品檢測結果的影響，通過實驗確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，申請人還應對可用于樣本稀釋的基質或處理方法進行研究，通過試驗確定最終選擇的用于樣本稀釋的基質或處理方法。

（七）分析性能評估資料

企業應提交在產品研制或成品驗證階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內控標準、試驗數據、統計分析等詳細資料。對于本類產品建議著重對以下分析性能進行研究。

1.最低檢測限（分析靈敏度）

選取特定滴度的ToRCH特異性抗體樣本，做系列倍比稀釋，將檢測結果的陽性率在90%以上（n≥20）的最大稀釋倍數作為試劑盒的最低檢測限。

對于有國際或國家定量參考品的檢測項目，（目前僅限于TOXO IgG和RV IgG）和半定量IgG檢測項目，最低檢測限的確定可采用在一次運行中將空白樣本重復測定20次，計算20次結果的均值與標準差SD，以空白均值加兩倍標準差的方法，或其它合理的方法。

2.抗體滴度變化（適用于半定量和/或定量檢測試劑）和診斷靈敏度

    ① ToRCH抗體檢測試劑：介紹血清轉換盤的組成和來源。檢測血清轉換盤，用于評價檢測試劑的診斷靈敏度及監測抗體滴度變化趨勢的能力。對于TOXO、RV等已有商業化血清轉換盤的檢測項目，應選用商業化血清轉換盤進行研究；對于部分無商業化血清轉換盤的檢測項目，可選擇合理的方法,如將標化的血清樣本稀釋等，對抗體滴度變化及診斷靈敏度進行評價。

  ② ToRCH IgG抗體親合力檢測試劑：對急性感染（3-4個月內）和既往感染樣本進行研究，樣本可來自于血清轉化盤或基于臨床診斷的臨床樣本，以評價臨床診斷靈敏度。

    3.分析特異性

（1）交叉反應

①對抗原結構相近或臨床癥狀相似的其他病原體（見表1）感染病人的高水平特異性抗體血清進行交叉反應研究，其中用于交叉反應研究用的抗體類型應與待測目的抗體類型相同，如檢測ToRCH IgG抗體，則應研究其與相關病原體特異性IgG抗體的交叉反應。

②高濃度病原體特異性IgG抗體與特異性IgM抗體的交叉反應驗證。

③如果檢測試劑采用基因重組抗原，應增加對重組基因導入微生物特異性抗體的交叉反應評價。例如，如果采用大腸桿菌作為宿主菌，采用原核載體作為表達載體，建議考慮大腸桿菌宿主自身蛋白以及載體骨架編碼的蛋白與被測物之間可能產生的交叉反應。

申請人應提交所有用于交叉反應驗證的病原體來源、濃度或滴度確認等信息。建議申請人將有關交叉反應驗證的信息以列表的方式在產品說明書的【產品性能指標】項中列出。

表1  用于交叉反應研究的病原體（推薦）

注：*標注的為必做項目

（2）干擾實驗

①內源性干擾

對樣本中常見的內源性干擾物質（見表2）進行檢測。方法為：對ToRCH特異性抗體陰性、弱陽性（臨界濃度）的臨床或模擬添加樣本分別進行驗證，樣本量選擇應體現一定的統計學意義，說明樣本的制備方法及干擾實驗的評價標準，確定可接受的干擾物質的極限濃度。

②抗凝劑的干擾

如果試劑盒適用樣本類型包括血漿樣本，應采用各種適用抗凝劑抗凝的血漿樣本分別與血清樣本進行對比實驗研究。方法如下：對不少于50例源自同一患者的ToRCH特異性抗體陰性和弱陽性（略高于CO值）的血清和血漿樣本進行檢測，以驗證申報試劑對于血清和血漿樣本的檢測結果的一致性；如適用于幾種抗凝劑，建議對不少于50例源自同一患者的ToRCH特異性抗體陰性和弱陽性（略高于CO值）的不同抗凝劑的血漿樣本進行檢測，以驗證抗凝劑之間的一致性。

③ 常用藥物的干擾

藥物干擾應包括常用處方及非處方藥物，如心血管治療藥物、降糖藥物、抗病毒藥物、抗生素和解熱鎮痛藥物等。建議申請人在每種藥物的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進行評價，方法可以參考相關的CLSI-EP文件或國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行。

 ④采用間接法檢測ToRCH特異性IgM抗體的試劑，在樣本處理環節應采用一定的方法去除樣本中的IgG類抗體以降低實驗中假陽性或假陰性的可能性。應以mg/dL為單位注明IgG吸附劑對樣本中人IgG抗體的吸附能力，并對吸附能力進行驗證。

⑤對于ToRCH特異性IgM抗體檢測試劑，建議對至少10份含有ToRCH特異性IgM抗體的樣本進行IgM破壞實驗研究，方法為采用特定的化學制劑（如2－巰基乙醇或二硫蘇糖醇）處理樣本后，重新進行檢測，IgM檢測結果應為陰性。

表2  建議用于干擾研究的物質（推薦）

4.精密度

具體實驗方法可以參考相關的CLSI-EP文件或國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等，針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑本身外，還應對實驗地點、檢測儀器等要素進行相關的驗證。

（2）設定合理的精密度評價周期，如有條件，建議申請人選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

（3）用于精密度評價的質控品應至少包含陰性、弱陽性和強陽性三個水平。

5.陽性/陰性參考品

如申報產品有相應的國家參考品，則企業內部陽性/陰性參考品應參考國家參考品的項目設置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結合實際情況設置合理的內部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產品，申請人應根據產品性能驗證的實際情況并結合國家標準或行業標準的相關要求（如有）自行設定企業內部參考品，陽性參考品應著重考慮抗體滴度要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應）的驗證情況。

申請人應對內部陽性/陰性參考品的來源、抗體滴度等信息進行精確的實驗驗證，并提交詳細的驗證資料。

6.鉤狀（HOOK）效應

須采用高滴度的ToRCH特異性抗體的血清進行梯度稀釋后由低濃度至高濃度開始檢測，每個梯度的稀釋液重復3-5份，對鉤狀效應進行合理的驗證。建議在產品說明書上明示對鉤狀效應的研究結果。

對于半定量和定量檢測試劑，除上述7條外，還應包含對稀釋線性（準確性）和檢測范圍的評估資料。

    1.稀釋線性（準確性）

可采用如下方法進行：對至少兩個水平的血清樣本進行梯度稀釋，計算稀釋血清的活性并與稀釋系數相乘以計算未稀釋血清的活性，比較計算所得抗體活性與已知值之間的差異。申請人也可以選擇其它合理的方式，如回收試驗等，對檢測范圍內的準確性進行評價。

2.檢測范圍

    建立試劑線性范圍所用的樣本基質應盡可能與臨床實際檢測樣本相似，理想的樣本為分析物濃度接近預期測定上限的混合人血清，且應充分考慮多倍稀釋對樣本基質的影響。建立一種定量測定方法的線性范圍時，需在預期測定范圍內選擇7-11個濃度水平。例如，將預期測定范圍加寬至130%，在此范圍內選擇更多的濃度水平，然后依據實驗結果逐漸減少數據點直至表現出線性關系，可發現最寬的線性范圍。   

（八）參考值（范圍）確定資料

重點提交對申報試劑陰性/灰區/陽性等結果判斷的CO（cut-off value）值確定的實驗研究資料，應包括具體的試驗方案、人群選擇、評價標準、統計學分析和研究數據等研究資料。建議采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的分析方式來選擇確定合理的CO值，如實驗結果分析存在灰區（equivocal zone），則應明確灰區建立的基礎。CO值建立的樣本來源選擇應考慮到地域性、季節、不同的感染階段和生理狀態等因素的影響，并明確CO值在不同的樣本類型是否有差異。對CO值建立后所產生的臨床靈敏度和特異性進行充分判斷，使產生假陰性或假陽性結果的可能性均降至最低。

對于采用酶聯免疫分析技術的檢測試劑，在各檢測條件固定的情況下，申請人也可以采用確定臨界值的常用方法，通過①確定臨界值中的n數值（臨界值=陰性樣品平均A值+n×標準偏差）；②確定陰性樣品A值的標準差；③臨床樣本臨界值的驗證。三個步驟檢測并計算確定試劑盒的臨界值。

（九）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性、高溫加速破壞穩定性、運輸穩定性及開瓶穩定性（如涉及）等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到樣本中抗體對儲存環境普遍敏感，申請人應對各種儲存條件下的樣本穩定性進行合理的驗證，以確認不同類型樣本的短期、長期保存條件及效期。需要冷凍保存的樣本應對凍融次數進行合理的驗證。某些用于防腐、冷凍用途或起穩定保護作用的添加劑（如疊氮化物）可能會對檢測造成影響，如涉及，請對該添加劑的影響進行合理驗證。

另外，如果要用于加熱樣本（如熱滅活）的檢測，則應對加熱前后的ToRCH特異性抗體陽性及陰性樣本進行加熱因素的干擾驗證。方法為對臨界值附近的至少10份弱陽性加熱和未加熱樣本進行對比檢測，比較檢測結果的差異；對至少10份陰性加熱和未加熱的樣本進行對比檢測，比較檢測結果的差異。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（十）臨床試驗資料

1. 研究方法

（1）對于“已有同種批準上市”產品的臨床研究，選擇已批準上市產品、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效。考慮到試劑盒的預期用途，臨床試驗中陽性和陰性樣本均應包括一定量的非凍存樣本比例。

 對于ToRCH特異性IgM檢測試劑申請人還應選擇不少于30例（TOXO IgM項目不少于10例）、處于感染急性期患者的新鮮采集樣本進行考核試劑與參考方法的一致性研究并以此判斷其臨床靈敏度和特異性。參考方法可以采用用于感染急性期判斷的方法，例如：ToRCH特異性IgG抗體的血清學轉換（動態監測2份或以上的血清IgG，恢復期與急性期比較IgG呈4倍以上升高）、核酸檢測或直接抗原檢測等方法，對于ToRCH感染急性期的判斷應密切結合患者的臨床診斷綜合進行。建議TOXO IgM檢測試劑進行與Sabin-Feldman染色試驗（DT）方法結合間接免疫熒光法的一致性研究。

（2）目前，部分IgG抗體親合力檢測項目無已上市的同類產品，對于該類申報試劑的臨床研究，建議以ToRCH特異性抗體血清學結果（包括血清學轉化）結合臨床診斷作為對比方法，進行臨床研究。

2.臨床研究單位的選擇

申請人在國內不同區域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區域代表性；臨床研究單位應具有ToRCH感染疾患診療或分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和對比試劑都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的對比試劑應保持一致，以便進行合理的統計學分析。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應選擇預期適用人群，包括高流行率地區育齡婦女及孕婦、具有ToRCH感染癥狀/體征、相似癥狀或與傳染源有密切接觸史等人群，作為研究對象。對于ToRCH特異性IgG半定量和/或定量檢測試劑，樣本待測物濃度應覆蓋檢測范圍。企業在建立病例納入標準時，應考慮到不同人群的差異，盡量覆蓋各類適用人群。臨床研究中ToRCH特異性IgM抗體陽性、特異性IgG抗體陰性樣本或IgG抗體低親合力樣本例數均不少于120例為宜，且每家醫院的陽性、陰性樣本例數應盡量考慮到樣本的分布。對于陰性病例的選擇，也應考慮對交叉反應和干擾因素的評價，企業應選擇除靶病原體之外的其他易混淆的病原體感染患者、自身免疫性疾病患者、溶血、脂血、黃疸樣本進行檢測，以從臨床角度考察其分析特異性。

CMV等ToRCH病原體的感染率較高，對該類ToRCH特異性IgG陽性的樣本，若隨機收樣進行IgG抗體親合力檢測，很難獲得近期感染的低親合力樣本。因此，建議先對入組樣本進行有針對性地篩選，如：選擇同一廠家的配套試劑盒檢測ToRCH特異性IgG抗體，選擇低濃度的IgG抗體作為親合力檢測的入組樣本；或者，選擇同一廠家的配套試劑盒檢測ToRCH特異性IgM和ToRCH特異性IgG抗體，二者同時為陽性的樣本可作為親合力檢測的入組樣本。建議在臨床報告的試驗設計和研究結果中對入組樣本的篩選過程進行詳細描述。

5.統計學分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、ROC分析和陰性/陽性符合率等。對于本類定性檢測試劑對比實驗的等效性研究，常選擇配對2×2表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行χ2檢驗或kappa檢驗以檢驗兩種檢測試劑檢測的一致性。統計學分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統計學差異，并驗證其一致性是否具有統計學意義。以kappa檢驗為例，除應計算kappa值外，還應對總體kappa值與“0”之間的差別是否具有統計學意義進行假設檢驗。對于半定量檢測試劑對比實驗的等效性研究，應在上述統計分析的基礎上，根據臨床試驗數據分布特點，采用Person相關系數等統計方法對考核試劑檢測值與對比試劑檢測值線性相關關系進行分析。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與對比試劑是否等效的標準。對于定量檢測試劑對比實驗的等效性研究，用回歸分析驗證兩種試劑結果的一致性，建議統計學負責人根據試驗設計特點，選擇適用的回歸分析方法，如Deming回歸、Passing-Bablok回歸分析等。

  6.結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對兩種試劑檢測結果明顯不一致的樣本，應采用金標準或臨床上普遍認為質量較好的第三種同類試劑進行確認試驗，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。如果考核試劑與對比試劑的檢測結果顯示不一致樣本均是位于二者的臨界值附近并且例數很少（如低于總例數的1%），則對不一致原因作簡要分析即可，不須進行第三方復核。注意，如果有必要選擇第三方試劑復核，建議先采用第三方試劑對一定數量的考核試劑和對比試劑檢測結果一致的樣本（包括陽性和陰性結果）進行檢測，以對第三方試劑選擇的合理性進行評估。

7. 臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

（1）臨床試驗總體設計及方案描述

① 臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。